202小程序美工4年5月，中国香料香精化妆品工业协会于江苏无锡国际会议中心，举办了2024中国化妆品科学技术大会暨第十五届学术研讨会。会议围绕“新质美丽，恒久绽放”为主题，专家院士、企业代表等汇聚一堂小程序美工，共探化妆品产业前沿技术创新。

会议期间，由环特生物所作论文《离体皮肤模型及其在化妆品功效评价中的应用》成功入选大会会议期刊优秀论文精选，不仅是环特多维生物技术平台可视化学术证据链新的落脚点，更是对离体皮肤（皮肤外植体）科学和化妆品产业有机融合的进一步的探究和突破。

离体皮肤模型又被称为皮肤外植体模型，作为一项皮肤科学的新兴技术，现如今正在扮演着愈发重要的角色。如何将离体皮肤（皮肤外植体）模型深度应用到化妆品功效评价之中，未来离体皮肤（皮肤外植体）技术的发展又能为我们创造出哪些全新的可能，且看下文一一为您阐述。

题目：离体皮肤模型及其在化妆品功效评价中的应用

会议：2024中国化妆品科学技术大会暨第十五届学术研讨会

时间：2024年5月

作者：龙洋、周示玉、沈佳琪

单位：杭州环特生物科技股份有限公司

01

研究背景

1959年，英国科学家RUSSELL和BURCH最先提出了3R理念，即减少（减少实验动物使用数量和实验次数）、优化（对必须使用的实验动物、优化动物实验流程和动物福利）、代替（低级动物替代高级动物、使用无知觉实验材料替代）的概念，并在当年出版的《人道实验技术原理》一书中发表了这一概念。2013年，欧盟全面禁止开展化妆品的动物实验，并禁止销售任何在动物身上进行安全测试的化妆品，包括化妆品原材料。随着3R理念的不断发展和欧盟动物实验禁令的颁布，化妆品及其原材料功效评价的体外替代模型及方法得以飞速发展。

离体皮肤也被称为皮肤外植体，它是由人体来源的皮肤组织经体外培养而获得的模型。离体皮肤通过适当的培养方式，可在体外维持一定的组织活力，目前，已被广泛应用于化妆品功效测评、伤口愈合、皮肤相关疾病的研究中。离体皮肤是最接近健康和患病皮肤生理机能的模型，包含完整的皮肤细胞类群如角质形成细胞、成纤维细胞、黑素细胞、朗格汉斯细胞；含有胶原蛋白、弹性蛋白、糖胺聚糖等细胞外基质；包含皮肤附属物如毛囊、汗腺等。

02

离体皮肤模型概述

离体皮肤的来源与体外培养

离体皮肤主要来源于临床捐献的或废弃的皮肤组织，它包含天然的皮肤结构，即包含完整的表皮层、真皮层、皮下组织、皮肤附属物。通过体外培养的方法，能够最真实地模拟人体皮肤在正常生理环境下的状态与功能。

常见的离体皮肤可来源于腹部、胸部、背部、面部、头皮、包皮等。选择性腹部、胸部、背部整形手术获得的离体皮肤，由于其很少暴露于外部因素（例如太阳辐射、空气污染等）中，所以保留皮肤组织最基础的特性，常被用来进行皮肤光老化、皮肤衰老、皮肤屏障等研究。头皮来源的离体皮肤由于包含完整毛囊结构，是研究头发生长、毛囊老化、防脱发的宝贵模型。

离体皮肤从临床上切除后，应尽快收集在含有0.9%氯化钠的溶液中，并放于4℃短期保存（4℃下可保存3小时）。使用离体皮肤作为研究模型的基本标准是保证样品厚度和尺寸的一致性，因此，可通过电动皮片机或手动皮肤取样器，将皮肤组织分割成相同大小的圆形皮片。制备好的皮片按照表皮层朝上真皮层朝下放置于含有庆大霉素和两性霉素B的DMEM高糖培养基中进行气液培养，或使用细胞培养插入模具以保持皮肤组织处于气液培养的环境，之后，将皮肤组织放置在37℃，含有5% CO2的培养箱内进行培养。

离体皮肤模型的应用与局限

离体皮肤由于其具有天然而复杂的皮肤结构，包括表皮层、真皮层、皮下组织、皮肤附属物、基底膜、细胞外基质等，而具备较为完整的皮肤功能，是最接近人体真实情况的模型，通过特定的培养方式，可在体外持续保持活力，因而被广泛的应用于皮肤相关疾病的研究、伤口愈合和疤痕的研究、皮肤渗透性的研究以及外用产品的功效和安全性评估。

离体皮肤作为与人体最接近的皮肤模型，其新陈代谢能力较强，皮肤渗透性与人体一致，不仅能在分子水平上进行机制的探究还能在组织水平表征皮肤结构和功能的变化过程。尽管离体皮肤作为动物试验的替代模型，已被广泛应用于皮肤相关疾病和外用产品的安全性和功效性研究，但仍具有较多的局限性，具体可总结为以下几点：

1）有限的来源。由于离体皮肤来源于手术废弃或捐献的人体皮肤组织，故而来源有限，无法大量获取，且无法像斑马鱼和细胞模型一样实现实验室或产业化大规模、高通量筛选。

2）法律法规和伦理道德的限制。用于科学研究的离体皮肤由于其来源特殊需经过医院或有关部门的伦理审查、获取患者的知情同意、且遵循 《赫尔辛基宣言》后才能使用。此外，相关法律法规的逐步完善可能对离体皮肤的获取与应用产生限制。

3）个体与皮肤部位的差异。来源于不同部位的离体皮肤可能需要不同的保存和培养条件；离体皮肤的部位、年龄或个体差异可能导致皮肤活力的不同，由此可造成模型不稳定、实验结果重复性和一致性较差。

4）体外保存和培养。离体皮肤保存、运输、培养的条件苛刻、成本较高，长时间的培养和操作过程将导致皮肤组织活力的下降和组织损伤。

5）生物安全性。离体皮肤来源于人体且存在生物活性，其对于研究人员存在一定的生物暴露的风险，在使用离体皮肤进行研究时小程序美工，应充分考虑生物安全等问题。

03

离体皮肤模型在化妆品功效评价中的应用

抗衰老功效

衰老是生物进程中自然发生的过程，皮肤形态和生理的衰退是衰老的第一征兆，也是最明显的临床特征。人类皮肤衰老分为内源性衰老和外源性衰老，逆转皮肤衰老或减缓皮肤衰老逐渐成为化妆品领域最为关注的焦点之一。皱纹是皮肤衰老最直观的表型，皱纹的形成与自然老化、光老化等密切相关，细胞外基质中胶原蛋白、弹性蛋白的减少是皮肤衰老和皱纹产生的主要原因。

图：原纤维蛋白1、弹性蛋白、纤连蛋白免疫荧光染色典型图

目前，已有许多研究证实离体皮肤是评价化妆品抗衰老功效的有效模型。ASSERIN等人利用离体皮肤的体外实验证实，胶原蛋白肽可诱导皮肤组织中胶原蛋白和糖胺聚糖的产生，由此可改善皮肤老化的标志。GREF等人发现适用于乳霜配方的维生素C-角鲨烯偶联物作用于离体皮肤之后，可显著增加表皮厚度，并促进胶原蛋白Ⅲ和糖胺聚糖的产生。将离体培养的皮肤外植体局部暴露于铜离子缓冲液中，不影响离体皮肤的活力或组织形态，且能够促进弹性蛋白、前胶原蛋白Ⅰ和TGF-β1的分泌，起到抵抗皮肤衰老的作用。茶碱通过降低MMP-2和MMP-9的表达、增加褪黑激素水平，维持细胞外基质的稳定性，拮抗ROS供体甲苯醌的刺激作用，从而起到抗衰老、抗氧化的作用。此外，离体皮肤还可以被用来进行化妆品配方筛选，例如，蓝铜肽和透明质酸是常见的两种护肤成分，将两者组合对Ⅳ型胶原蛋白的生成具有协同作用，研究人员发现二者在1:9的比例下可将胶原蛋白Ⅳ的合成提高2.03倍。

屏障修护功效

图：FLG免疫荧光染色典型图

皮肤作为人体最大的器官在保护人体免受有害物质的入侵中发挥着重要的作用，在线全职美工其中皮肤屏障在其中起关键作用。皮肤屏障是由角质层、角质细胞间脂类及天然保护因子构成，90%的皮肤屏障功能依赖于角质层。角质层的形成涉及几种重要的角蛋白中间丝相关蛋白的表达，包括丝聚合蛋白（Filaggrin）、兜甲蛋白（Loricrin）、内披蛋白（Involucrin）、小分子富含脯氨酸蛋白（SPRPS）等。

图：LOR免疫荧光染色典型图

研究人员发现，离体培养48小时的全层皮肤可保持屏障特性，且能对不同强度的屏障破坏做出反应，使用胶带剥离或4小时十二烷基硫酸钠（SLS）处理通过破坏皮肤结构、促进炎症因子IL-6、IL-8的表达破坏皮肤屏障。使用1:1（v:v）乙醚：丙酮混合物对离体皮肤进行损伤造模，PPAR-α激动剂RFV3可通过增加神经酰胺、丝聚蛋白和转谷氨酰胺酶1的表达来促进离体皮肤的屏障修护过程。离体皮肤模型还被用来评估清洁产品的功效，ZHOU等人通过对沐浴露A和沐浴露B处理的离体皮肤进行免疫荧光染色发现，与水对照和沐浴露A处理相比，经沐浴露B处理的离体皮肤在处理7天后，颗粒层和角质层中丝聚蛋白的表达显著减少，证明沐浴露B对皮肤屏障具有破坏作用，此外，使用MTT检测离体皮肤的组织活力也是用来评价皮肤屏障修护功效的重要指标。

抗糖化功效

糖化反应，又称美拉德反应，其晚期糖基化产物也被称为AGEs，AGEs随着年龄不断累积，一方面会通过改变真皮ECM的功能使细胞形态改变，另一方面会通过激活下游信号通路，影响细胞、组织功能，促进皮肤衰老。具有抗糖基化活性的天然化合物可能具有较大的抗衰老潜力。糖基化诱导剂甲基乙二醛（MGO）可诱导糖基化产物的产生，在MGO造模的情况下，SHIN等人利用离体皮肤研究了没食子酸甲酯的抗糖化作用，没食子酸甲酯通过降低羧甲基赖氨酸（CML）的表达、刺激纤维蛋白I的表达来发挥其抗糖化作用。另一项在离体皮肤中的研究表明，氨基胍、葛根素、绿原酸可促进纤维蛋白I的产生和抑制CML的产生，这表明这些活性成分具备抗氧化和抗糖化的功效。此外，与MGO处理相比，水飞蓟花提取物水飞蓟宾涂抹8天，可显著降低皮肤外植体中CML的表达。

保湿功效

充足的水分是皮肤保持健康和正常功能的基础，皮肤保持水分的能力主要与角质层有关，角质层起到防止水分流失的作用，这一作用主要与天然保湿因子和角质层细胞间脂质有序排列形成的跨表皮失水屏障有关。水通道转运蛋白3（AQP3）以及颗粒层和角质层交界处紧密连接结构在皮肤水分保持和屏障功能中发挥作用。透明质酸（HA）是一种内源性皮肤基质成分，具有保湿、抗炎等特性，对维持正常的角质层结构和表皮的屏障功能至关重要。含有透明质酸的化妆品配方可以增强皮肤结构、滋润皮肤、减少皱纹。

图：ELISA检测透明质酸HA含量

已有多篇文献报道了使用离体皮肤模型研究化妆品及其原材料的保湿功效，例如化妆品配方原料绿咖啡油（GCO）孵育离体皮肤，可显著增加AQP3的表达，以此来改善皮肤生态，防止表皮干燥。全反式维甲酸（ATRA）的局部处理可显著增加离体皮肤表皮基底层中AQP3的表达，增强其免疫反应性。使用不同浓度的视黄醇连续处理离体皮肤，使用生物素化抗透明质酸结合蛋白（HABP）抗体进行染色，发现稳定的视黄醇配方促进了离体皮肤中HA的产生，且视黄醇通过促进皮肤组织中HAS3基因的表达来增强皮肤的保湿作用。此外，另有一项研究使用离体皮肤和ELISA检测方法，对比了高分量和低分子量的HA配方处理后HA在角质层中的扩散情况，并为人体临床试验提供了最佳建议。

透皮吸收

物质的透皮吸收是指其作用于皮肤表面后进入表皮或真皮，并在该部位聚集并发挥功效的过程。化妆品在皮肤中的渗透性是其发挥功效的重要前提，研究物质在皮肤中的渗透与分布，可为产品配方优化、功效评价等提供重要的数据支持，而离体皮肤是研究物质透皮吸收不可或缺的模型。

详情页设计

图：环特生物离体皮肤拉曼光谱成像典型图

将离体皮肤与Franz扩散法、高效液相色谱（HPLC）检测技术结合，是目前普遍且应用广泛的化妆品透皮吸收检测技术。已有研究人员利用此方法探究辅酶Q10的卵磷脂微乳液和亲水乳膏配方对皮肤渗透性的影响。二氢槲皮素是具有抗氧化活性的黄酮醇，通过离体皮肤的Franz扩散-HPLC检测，发现二氢槲皮素水包油乳液的渗透性可达到48.09%每剂，且HPLC检测具有精确性（CV<5%）、准确性（回收率在98%和102%之间）、线性（R2>0.99）。虽然HPLC对待测物质的渗透性有着精准地检测，但此种方法无法实现对待测物质的渗透性进行可视化的分析，将离体皮肤、Franz扩散法与拉曼光谱技术相结合极大地弥补了这一缺口。拉曼光谱是一种振动光谱，是物质的一种固有属性，已被广泛应用于物质的成分鉴定、分子结构、谱线特征等研究。有文献报道了使用拉曼光谱成像技术检测水杨酸在皮肤中渗透行为，水杨酸的浓度分布以热图的形式展现，拉曼光谱成像结果与HPLC结果得到的目标浓度变化趋势一致。KANG等人将拉曼光谱与多元线性回归算法结合，通过计算待测物的浓度贡献因子，将其分布情况可视化为热图，并采用次方法获得了透明质酸和利多卡因在皮肤中的渗透图像。这些实验结果均表明离体皮肤模型和拉曼光谱技术在化妆品透皮吸收研究中的可靠性和可视化性。

04

结语与展望

不同于新兴的3D重组皮肤模型、皮肤类器官和器官芯片模型，离体皮肤虽然拥有较为久远的发展历史，但由于其具有伦理限制、获取困难、个体差异等特殊的局限性，在化妆品领域的应用并不广泛。与传统的细胞模型相比，离体皮肤不仅可以在分子细胞水平实现对待测物的评估，更能在组织水平评估待测物的功效，具有良好的可视化和宣传效果。已有大量的研究表明，离体皮肤是研究经皮给药、化妆品及原材料功效、药品和化妆品安全性、刺激性和毒性的有效替代模型，也逐渐被国内外药品和化妆品的原料商、出品方、监管机构和消费者所认可。离体皮肤在化妆品领域的应用或将弥补化妆品安全性和功效评价体系的缺口。然而，目前国内外仍缺乏离体皮肤用于化妆品功效评价的行业标准和监督管理规范，未来可通过起草离体皮肤评价方法的技术指南、制定离体皮肤用于化妆品功效评价的标准规范、完善化妆品安全监管的法律法规文件，进一步提高离体皮肤模型在行业内的认可度、扩大离体皮肤模型在化妆品领域的应用范围。

随着新原料的开发和化妆品技术的不断发展，化妆品行业的市场竞争也日渐激烈，这些现状对化妆品及其原材料的功效评价方法的开发和模型的建立提出了更多需求，也对用于化妆品功效宣称的评价体系提出了更全面的要求。化妆品及其原材料种类繁多、作用机制复杂，单一的评价方法或使用单一的评价模型难以全面、科学、准确地评价其功效。因此，在进行化妆品功效评价或验证的过程中，应采取多指标、多模型、多维度的检测，形成综合、高效、系统的评价体系。

全文请关注环特生物化妆品公众号：化妆品CRO服务站小程序美工

发布于：浙江省特别声明：以上内容（如有图片或视频亦包括在内）来源于网络，不代表本网站立场。本网站仅提供信息存储服务。如因作品内容、版权和其他问题需要同我们联系的，请联系我们及时处理。联系方式：451255985@qq.com，进行删除。